现场直击!实现大量CAR-T细胞的高效制备，武大团队研发等渗电转手段，为非病毒递送构建CAR-T的临床转化奠定基础

　　原标题：实现大量CAR-T细胞的高效制备，武大团队研发等渗电转手段，为非病毒递送构建CAR-T的临床转化奠定基础

　　来源：DeepTech深科技

来源：DeepTech深科技

　　自 2017 年 CAR-T 细胞免疫疗法（下称“CAR-T 疗法”）被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准作为第一个用来治疗白血病的细胞疗法以来，全球已经有 8 款 CAR-T 产品获批上市。

　　其中，中国国家药品监督管理局批准上市了两款，分别为奕凯达和倍诺达；FDA 批准了 6 款，分别为 Kymirah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma、Carvykti。

　　这些产品可用于治疗急性淋巴白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤等恶性血液肿瘤。

　　整体来看，CAR-T 疗法在治疗恶性血液病方面取得了突破性疗效，并为治疗实体瘤开辟了新的可能性。

　　迄今为止，已知的所有获 FDA 批准商业化的 CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）疗法，都是使用 γ- 逆转录病毒载体或慢病毒载体进行递送。

　　然而，目前使用的病毒递送系统存在一些潜在限制，比如存在病毒随机嵌合基因组所带来的安全隐患、基因表达稳定性不足、免疫原性、生产成本较高等。

　　为了克服这些挑战，学界正在积极研究开发非病毒递送方法，以期提高 CAR-T 疗法的治疗效果。

　　其中，利用电转 CRISPR/Cas9 系统和编码 CAR的 dsDNA 模板来构建 CAR-T 疗法，是被研究得最为广泛的方法。

　　但是，多支科研团队发现，电转 dsDNA 会造成严重的原代 T 细胞死亡，因此需要经过流式分选富集编辑后的活细胞，这极大限制了由非病毒递送系统构建的 CAR-T 疗法在临床上的广泛应用。

　　当下，制备 CAR-T 的主要方法，是利用慢病毒递送 CAR 载体进入免疫细胞。

　　截止到现在，已有 8 款由慢病毒载体制备的 CAR-T 产品进入市场。

　　慢病毒制备涉及到病毒规模化生产，制造成本很高，这导致每个产品的单价都在 100-300 万不等。

　　比如，2021 年 120 万一针的 CART 抗癌药就曾引起网友热议，这是一个普通家庭很难承受的价格。

　　除此之外，当慢病毒进入细胞后，就会随机嵌入基因组之中，由于每个细胞嵌入的基因组位点均不一样，因此存在表达不均一和随机嵌入所带来的安全性风险。

　　相比慢病毒载体，非病毒递送系统具有许多优势。

　　非病毒递送系统包括三个成分：Cas9、gRNA、以及编码 CAR 的双链 DNA。

　　通过 Cas9 和 gRNA 在基因组的特定位点切割，非病毒递送系统能将 CAR 精准整合到基因组特定位点。

　　在非病毒递送过程中，由于不涉及病毒的使用，因此可以避免病毒发挥毒性。

　　同时，非病毒构建 CAR-T 时所需要的 Cas9 蛋白、sgRNA、以及编码 CAR 的 DNA 模板均易制备和量产，故能极大简化 CAR-T 制备的成本和时间。

　　在基因组特定位点精准嵌入 CAR，可以实现更高和更稳定的表达，这也是 CAR-T 疗法获得成功的关键因素之一。

　　除此之外，使用非病毒递送 CRISPR/Cas9 构建 CAR-T，既能实现定点整合 CAR、避免随机插入的风险，又能同时调控内源性基因比如 TRAC、B2M、PD1 等。

　　虽然非病毒递送更加简单高效，但是现有电转递送双链 DNA 的方法，常常伴随大量细胞毒性，这会导致免疫细胞的死亡，以至于无法高效制备 CAR-T 细胞。

　　如何高效地制备大量 CAR-T 细胞

　　基于此，武汉大学医学研究院教授张楹和合作者希望能够解决电转递送 DNA 所产生的细胞毒性。

　　在近期一项工作中，在研究产生细胞毒性的分子机制之后，他们证明电转 DNA 诱导原代 T 细胞死亡的原因，在于激活了 cGAS-STING 通路。

　　其还发现，改变电转缓冲液的渗透压，可以调控上述通路的激活。

　　利用等渗电转缓冲液可以显著降低 cGAS-STING 激活程度，进而提高 T 细胞活力。

　　相较于商业电转，等渗电转制备出的 CAR-T 细胞高出 20 倍之多，从而能为非病毒递送构建 CAR-T 的临床转化研究奠定基础。

　　除此之外，由于 T 细胞不具备调节自身细胞大小的能力，很容易受到环境渗透压影响。

　　而等渗环境可以促进电转产生的膜孔融合，从而提高电转后的细胞活力和增殖。

　　研究中，张楹等人通过揭示电转 DNA 导致细胞毒性的分子机制，进而寻求调控 cGAS-STING 通路的方法，最终降低细胞的毒性。

　　他们发现电转 DNA 导致的细胞毒性，是源于激活了细胞内的天然免疫通路 cGAS-STING。

　　由于 STING 的小分子抑制剂和 siRNA 均存在自身局限性，无法有效恢复电转 DNA 所来带的细胞毒性。

　　于是，他们另辟蹊径从电转入手，利用高通量筛选来提高 DNA 递送效率和细胞活力的缓冲液。

　　在筛选几百种电转条件之后，课题组发现电转缓冲液 B1mix 可以显著降低 cGAS-STING 通路的激活，从而提高 DNA 的递送效率和细胞活力。

　　进一步地，他们又对电转机制进行研究，结果发现电转缓冲液的渗透压，可以直接调控 cGAS 与 dsDNA 的结合亲和力，进而调节 cGAS-STING 激活。

　　与此同时，等渗电转缓冲液可以极大降低上述通路的激活和细胞死亡，从而实现 CAR-T 细胞的高效制备。

　　事实上，电转递送是一个很成熟的领域，针对它的相关研究主要集中在 20 世纪 90 年代以前。

　　而该团队通过在成熟领域里寻找创新点，揭示了电转缓冲液的渗透压可以调控细胞内的分子互作作用。

　　其还证明通过改变电转缓冲液可以显著提高 CAR-T 制备，在机制上揭示了渗透压这一影响递送的关键因素，为调控 cGAS-STING 通路的激活打开了新思路。

　　此外，在造血干细胞以及小鼠 T 细胞中，这种新的电转方法均能提高它们的递送效率，这对于其他领域的研究也非常有价值。

　　三次补充实验与上百种电转缓冲液

　　据介绍，论文从第一次投稿到接收，前后累计补充 3 次实验。

　　每一次审稿人的意见都会给他们带来不同的启发。

　　在第一轮审稿意见中，两位审稿人都提出同一个问题：新电转缓冲液促进 DNA 入核的机制是什么？

　　为回答这个问题，课题组解析了电转过程中的每一个步骤，并从不同的角度去研究，比如膜融合过程、电转缓冲液的成分、理化性质等。

　　为了探索是否存在某种成分直接影响 DNA 递送，他们将电转缓冲液的成分进行逐一删减或逐一增加，借此配制成新的电转缓冲液。

　　张楹表示：“这是一个巨大的工作量，我们前后一共试了上百种电转缓冲液，最终发现电转缓冲液的渗透压起着至关重要的作用，与具体的成分无关。

　　”

　　论文发表后，课题组收到来自业界的大量咨询，目前他们正和业界积极合作探索转化的可能。

　　细胞治疗产业蓬勃发展，据估计到 2030 年全球细胞产业可以达 600 亿美金。

　　截止到 2022 年，已有 57 项基因编辑的细胞疗法进入临床实验，包括肿瘤免疫（38 项）、地中海贫血症（15 项）和糖尿病（4 项）。

　　这些细胞疗法可以通过电转递送基因编辑工具，通过增强细胞功能达到疾病的治疗。

　　而本次的电转方法不仅可以提高 DNA 递送效率，也可以在多种原代细胞中提高 mRNA 和蛋白的递送效率，因而在细胞治疗领域有着极大的应用前景。

　　利用这一递送方法，在降低原料用量的同时，并不会影响递送的效率和稳定性，这能助力于实现降本增效，进一步推动细胞治疗产业的发展。

　　同时，本次研究还发现电转缓冲液除能提高 DNA 递送效率之外，对于 mRNA 和蛋白的递送效率也可以显著提高。

　　后续，他们将继续改进配方，希望能在现有基础之上将 mRNA 的递送效率再次提高 2-4 倍。

　　同时，他们也正在开展机制解析，以期可以解决 mRNA 递送的问题。

　　1. An, J., Zhang, CP., Qiu, HY. et al. Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS–STING pathway. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01073-7

　　运营/排版：何晨龙

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